酶免疫分析试剂盒实验步骤

A. 试剂制备

1. 使用前，让全部微孔板条达到室温。
2. 通过在 Milli-Q 或同等纯化的水中稀释 20 X 洗涤缓冲液（包含于每个试剂盒中），制备 1 X 洗涤缓冲液。
3. 在 Milli-Q 或同等纯化的水中稀释 10 X Cell Lysis Buffer #9803 至 1 X。应当每次现添加 1 mM 苯甲基磺酰氟 (PMSF)。这种缓冲液可以贮存在 4°C 供短期使用（1–2 周）。

B 细胞裂解物制备

注：这个步骤用于 96 孔组织培养板。可以在对其修改后用于其他组织培养板（6、12、24 或 48 孔）。

1. 将目的细胞铺种于 96 孔板中（一般在 6–100 X 10³个细胞/孔之间）并且在适宜的细胞培养条件下孵育过夜。
2. 用 200 µl 温暖的 PBS 润洗细胞，随后在无血清培养基中添加测试化合物并且将细胞孵育所需时间段。
3. 用 200 µl 冰冷的 PBS 润洗细胞 2 次，并且随后添加 100μl/孔 1 X 裂解缓冲液，于冰上放置 5-10 分钟。

注：如果观察到细胞残片，可以通过短暂离心平板移除它，并且将清亮裂解物转移至新的 96 孔板。

C. 测定

1. 让全部试剂盒组分回复至室温。
2. 添加 50 µl HRP 连接的靶标溶液和 50μl 样品至抗体包被的分析平板。盖住平板并且在水平圆周式平板摇床上室温孵育 3 小时。
3. 弃去平板内容物并用 200μl/孔 1 X 洗涤缓冲液洗涤各孔 4 次。确保每次洗涤后弃去全部液体，但不应让孔完全干燥。
4. 添加 100μl TMB Substrate。
5. 在室温孵育 30 分钟。

注：随着显色进展，观察颜色，因为可能需要在第 30 分钟之前终止反应。

6. 添加 100μl STOP Solution。
7. 测量吸光度在 450 nm（为得到最佳结果，在添加 STOP Solution 后 30 分钟内读取平板）。

注：为了确定受检物质的绝对量，需要每次都生成标准曲线。请遵循产品数据表上的详细实验步骤以确定标准曲线的浓度范围。