细胞内蛋白质印迹法实验步骤

A. 溶液与试剂

注：用超纯水或相当的纯净水制备溶液。

1. 10 X 磷酸盐缓冲液 (PBS)：为了配制 1 L，添加 80 g 氯化钠 (NaCl)、2 g 氯化钾 (KCl)、14.4​g 磷酸氢二钠 (Na₂HPO₄) 和 2.4​g 磷酸二氢钾 (KH₂PO₄) 至 1 L dH₂O。调节 pH 至 7.4。
2. 甲醛, 16%, 无甲醇，Polysciences 公司出品。（货号#18814 ），使用新鲜制剂，小瓶打开后避光 4°C 保存，在 PBS 中稀释后使用。
3. 封闭缓冲液：准备 25 ml 缓冲液，将 2.5 ml 10X PBS，以及1.25 ml 与二抗同一物种来源的正常血清（例如 正常山羊血清 (#5425) ，正常驴血清）加入到 21.25 ml dH₂O 中并混匀。搅拌时加入 75 µl Triton X-100 (100%)。
4. 抗体稀释缓冲液： 要制备 40 ml 溶液，将 4 ml 10X PBS 加入到 36 ml dH₂O 中并混匀。加入 0.4 g BSA 并混匀。搅拌时加入 120 µl Triton X-100 (100%)。
5. 荧光素标记二抗。

注：首次使用一抗或荧光素标记二抗时，将抗体滴定至最佳稀释比例，使样品在最少的背景干扰下，获得最强的特异性信号。

B. 固定和免疫标记

注：对于每个抗体，请参考免疫荧光法实验步骤，以确定推荐的抗体特异性固定和通透化条件。

注：细胞应当在多孔板上直接培养、处理、固定和染色。

注：为避免单个孔中细胞分布不均导致的边界效应，将新接种的细胞板在室温下放置一小时，再放入 37°C 的孵箱中（更多信息请参考文献 Lundholt BK, Scudder KM, Pagliaro L. A simple technique for reducing edge effect in cell-based assays. J. Biomol. Screen. 2003 8, 566–70）。

注：为了将来自散射光和背景荧光的错误信号减到最小，请使用黑壁多孔板（例如 BD Falcon, 货号 353948）。

注：避免移液器或吸引器接触到孔板内部，因为这样会留下人为假象，影响后续定量。相反，清空孔板时在废物缸上方将其倒置并剧烈摇晃，再用纸巾吸干。

注：下面列出的体积适用于标准的 96 孔板。根据细胞板上或大或小的孔调整液体体积。

1. 按需要在多孔板中培养和处理细胞。
2. 按照抗体专用免疫荧光法实验步骤中的推荐，用 50 µl 4% 甲醛或 100% 甲醇固定细胞。
3. 室温下固定细胞 15 分钟。
4. 在废物缸上方将孔板倒置并剧烈摇晃，再用纸巾吸干。
5. 使用室温 PBS（100 µl/每孔）将细胞板清洗三次，每次 5 分钟。
6. 室温下用封闭缓冲液（50 µl/每孔）将细胞封闭一小时。
7. 封闭样品时，可按照数据表中推荐的适用于免疫荧光 (IF-IC) 的比例，用抗体稀释缓冲液配制一抗。
8. 倒出封闭液并加入已稀释的一抗（总体积 50 µl/每孔）。

注：要进行双标，将小鼠来源和兔来源的一抗混合，并按其合适的稀释比例在抗体稀释缓冲液中稀释。

9. 盖上细胞板并在 4°C 下过夜孵育。
10. 用 PBS 清洗细胞板三次，每次 5 分钟。
11. 将荧光标记二抗*在抗体稀释缓冲液中稀释（总体积 50 µl/每孔），然后在室温条件下避光孵育一小时。

注：要进行双标，将荧光标记的鼠抗和兔抗二抗混合，并在抗体稀释缓冲液中稀释。

12. 用 PBS 清洗细胞板三次，每次 5 分钟。
13. 在缺乏基于抗体的解析时为标准化细胞数量，用 DRAQ5 按 1:1000 在 PBS 中稀释后标记胞核（总体积 50 µl/每孔）。扫描之前，在室温条件下至少避光孵育 30 分钟。

注：DRAQ5 不能与 DyLight 680 偶联二抗配合使用。DRAQ5 的发射光谱和 DyLight 680 重叠，无法区分每种染料产生的信号。

注：为达到更佳的光学分辨率，可清空 DRAQ5，并用 PBS 清洗孔板至少一次。

14. 根据制造商的说明书扫描孔板。（确保在扫描之前细胞板底部已擦干净）。

*推荐的二抗：

兔抗

• Anti-Rabbit IgG (H+L) (DyLight 680 Conjugate) #5366
• Anti-Rabbit IgG (H+L) (DyLight 800 Conjugate) #5151

鼠抗

• Anti-Mouse IgG (H+L) (DyLight 680 Conjugate) #5470
• Anti-Mouse IgG (H+L) (DyLight 800 Conjugate) #5257