Cell Signaling Technology

CST抗体选择指南

        很多刚刚开始信号通路研究的朋友,在访问CST网站(CST英文官网:www.cellsignal.com; CST中文官网:www.cst-c.com.cn)查找抗体的时候,常常被多个抗体货号和不同的抗体信息所困扰,不知道该如何选择合适的抗体。为此,CST的技术支持团队希望通过这篇文章,系统介绍抗体的相关背景知识,为大家正确选择适合自身研究需要的CST抗体提供帮助。

一、CST抗体的制备工艺

        根据抗体制备的原理和方法,主要分为单克隆抗体、多克隆抗体和基因工程抗体三大类。

        早期传统的抗体制备方法是将抗原经各种途径免疫动物,由于抗原物质具有多种抗原决定簇,故可刺激产生多种抗各种决定簇的抗体,形成细胞克隆,合成和分泌抗体到血清或体液中,故在其血清中实际上是含多种抗体的混合物,这种用体内免疫法所获得的免疫血清为多克隆抗体(polclonal antibody, Pab),也是第一代抗体。由于这种抗体是不均一的,无论是对抗体分子结构与功能的研究或是临床应用都受到很大限制,因此如何能获得均一性抗体成为关注的问题。

        如能将所需要的产生抗体的细胞株系选出并能在体外进行培养即可获得特异的单克隆抗体(monoclonal antibody, Mab),它是由识别一种抗原决定簇y的细胞克隆所产生的均一性抗体,目前很多单克隆抗体大都利用杂交瘤细胞技术产生,这种用杂交瘤技术制备的单克隆抗体可视为第二代抗体。单克隆抗体由于纯度高、特异性强、可以提高在各种抗体应用中检测抗原的敏感性及特异性,已经被广泛采用。

        CST的单克隆抗体主要为兔源和鼠源两大类。由于CST在单克隆抗体的细胞克隆筛选和多种应用的验证等方面非常严格,保证了CST单克隆抗体保持着业界的领先水平。目前,CST最高品质的抗体被称为XP®(eXceptional Performance)级别的单克隆抗体,这些抗体无论在效价、应用类型和种属、特异性等方面的表现都更加卓越,也是我们重点推荐的新一代产品。

 

        由于需要研制人源单克隆抗体用于临床治疗,基因工程抗体(genetically engineering antibody)技术在80年代早期兴起。这一技术是将对Ig基因结构与功能的了解与DNA重组技术相结合,根据研究者的意图在基因水平对Ig分子进行切割、拼接或修饰,甚至是人工合成后导入受体细胞表达,产生新型抗体,也称为第三代抗体。

        基因工程抗体包括嵌合抗体、重构抗体、单链抗体、单区抗体及抗体库等。CST近年来一直致力于新型基因工程抗体的研究并尝试用于治疗性抗体开发,并于2012年首次在《Nature Biotechnology》杂志公布最新的研究进展——A proteomics approach for the identification and cloning of monoclonal antibodies from serum,CST将这种技术称为NG-XMT™技术,这是一种结合了下一代测序技术(NG-sequencing)和蛋白组学技术从抗血清中进行克隆筛选和鉴定的基因工程抗体制备工艺,能够大大提高治疗性单克隆抗体制备的效率。

二、CST一抗(primary antibody)的选择

        正确选择CST一抗一般需要如下几个方面的信息:

1)蛋白的名称及亚型:某些蛋白具有多种不同的亚型,如IKK、PKC、p38等,这需要在选择抗体之前确定要研究的蛋白亚型。还有些抗体由于其抗原选择的是不同蛋白亚型共有的肽段区域,是可以同时识别多个亚型的,我们一般都会在抗体的名称中加入(pan)字样来标明,如Akt (pan) (C67E7) Rabbit mAb #4691,就可以识别Akt1、2、3等多个亚型,结果反映的也是所有Akt亚型的总水平。

2)磷酸化修饰位点:由于CST抗体有很多是针对蛋白的磷酸化修饰位点,因此CST抗体的命名往往会在蛋白名称后加上括号来标注,如Phospho-4E-BP1 (Ser65) Antibody #9451,Ser65即此抗体识别的修饰位点,在选择合适的CST抗体用于特定修饰位点研究时,需要特别注意。有关不同修饰位点的功能,可以通过查阅文献确定,或登陆http://www.phosphosite.org(目前最全的蛋白修饰位点数据库)查询,也可以通过点击CST网站该产品页面中的Background(背景知识)来获取。另外,由于有的蛋白存在不同亚型且序列高度同源,而不同亚型的某些磷酸化修饰位点周围的序列完全相同,因此CST的某些抗体往往会同时识别不同亚型的相似修饰位点,如Phospho-IKKα/β (Ser176/180) (16A6) Rabbit mAb #2697既可识别Ser176位点磷酸化的IKKα,也可以识别Ser180位点磷酸化的IKKβ,结果反映的也是两者共有的水平。

3)抗体已验证的应用(如WBIHCIP等):CST抗体一般会在出厂前对常见的抗体应用(WBIHCIP, ChIPIFFlow)进行内部验证,以确定可以满足的不同应用要求。通过验证,达到质检要求的抗体会明确标记,以备参考。一些没有标明的应用,往往是因为经过验证没有达到质检标准而不推荐。比如Acetyl-Histone H3 (Lys18) (D8Z5H) Rabbit mAb #13998可以满足除IF以外的所有其他5种应用,有的客户会认为,既然该抗体可以用于IHC,根据经验推断应该可以用于IF,那么很有可能会浪费很多时间和试剂而不能获得结果。也有一些没有标明的应用,可能是因为我们没有用于检测的样本而没有检测CST不推荐您使用没有标明的应用。可以挑选其他的货号,我们可能有适用于这个应用的更好的其它产品。

另外,一般直接带有偶联物的一抗,只能用于特定的应用,也会明确标记。

4)抗体能够识别的样本种属:CST抗体一般会在出厂前对常见的不同种属目标样本进行内部验证,以确定可以满足的不同种属类型,可以在产品页面的Species-Reactivity一栏中看到(如人、小鼠、大鼠等)。通过验证,达到质检要求的种属会明确标记,以备参考。对于有些抗体,在 Species-Reactivity 的种属里,有些种属会加上括号,这表示根据序列同源比对,是100%符合的,但是我们并没有做过关于这些种属的实验,所以不建议使用。

一些没有标明的种属,也有可能是可以应用的,建议通过联系CST技术支持tech@cst-c.com.cn来获得相关抗原序列比对的信息,以确定是否可以用于该种属的样本。

5CST制备抗体的抗原:抗体是由各种不同免疫原免疫宿主而制备得来,其中的免疫原包括:全长蛋白、蛋白片段、多肽、全有机体(如:细菌)或细胞,CST抗体说明书一般都有免疫原的描述,如果打算检测的是蛋白片段或一种特殊的同型物或蛋白全长的某一区域,则必须选择用含此片段域的免疫原制备出的抗体。如果打算用FACS流式检测活细胞的表面蛋白,则需要选择含该表面蛋白的胞外域来免疫制备的抗体。不同类型的抗原对所得到的抗体会对其应用产生一定影响。CST科学家一般都会对抗体制备所用的抗原进行说明,并对抗体的各种常规应用在出厂前进行验证,以确定该抗体能够满足的应用。

6)抗体的动物来源:CST一抗(primary antibody)的动物来源多为兔(rabbit)和小鼠(mouse),动物来源和单/多抗信息可通过产品名称和产品页面或说明书的Source / Purification得到。由于很多抗体的应用(如IHC,IF等)需要通过第二抗体(二抗)的进一步结合和信号放大,而第一抗体是通过特定抗原免疫动物而获得,产生抗体的动物来源也决定着第二抗体的选择。一般说来,在使用无偶联物的一抗时,一抗宿主动物的物种选择较为重要,对于免疫组化而言,尽可能选择与样本不同种系物种的一抗,从而避免二抗与样本内源性免疫球蛋白产生交叉反应,例如:检测小鼠样本蛋白,则不应选择小鼠或大鼠源的一抗,最好选兔源的一抗。 

7)抗体的克隆号(如D6B6:CST的某些抗体会含有克隆筛选过程中确定的原始克隆位置编号信息,如Phospho-EGF Receptor (Tyr1173) (53A5) Rabbit mAb #4407中的53A5就是原始的克隆号。这些信息一般对于抗体选择没有太大的影响,只是当同样的修饰位点有不同的克隆来源时,用克隆号标注以示来源不同。

8)抗体的规格:CST抗体一般有3种规格,分别是40 µl ( 4 western blots )、100 µl ( 10 western blots ) 和300 µl ( 30 western blots )。最为常见的是100 µl ( 10 western blots )。10 western blots 代表该抗体可以做 10 次标准 western blots 膜的孵育,即大约可做100个样本。具体计算如下:该抗体用于 WB 的稀释比例为 1:1000,我们假定一张膜最多用 10 ml 一抗工作液孵育,那么,需用 10ml 的 TBST, 按照说明书上建议的 5%BSA 或者 5% non-fat milk, 加入 10ul 的抗体配置成一抗工作液。因此,100ul 一抗原液可用于 10 次 western blots。

        以查找ISG15抗体为例,首先登陆CST公司网站,然后在 Search方框里输入ISG15,会出来#2578#2743这两个抗体,让我们看一下它们的区别:#2758 是个兔单抗,括号里的 22D2 代表克隆号,可以做的实验是 Western(免疫印迹)、IP(免疫沉淀),可应用的种属是 H(人)和 Hr(马);#2743 是个兔多抗(可查看产品信息页面“Source / Purification”部分),可以做的实验是 Western、F( 流式细胞术 )、E-P( 以肽为包被抗原的 ELISA),应用的种属是 H、M(小鼠)、Mk(猴子)。如果说你要做 Western,所用的样本来自人,那么这两个抗体都是可以的。

三、CST二抗(secondary antibody)的选择

        二抗的选择首先要考虑一抗的物种来源,例如:如果选择的一抗是小鼠的单克隆抗体,二抗则选抗小鼠的二抗anti-mouse secondary。其次,二抗的选择要考虑具体的应用类型,CST提供的二抗根据不同的应用分为两大类:酶联(HRP或AP偶联)二抗(免疫印迹和免疫组化应用)和荧光二抗(免疫荧光和流式应用)。

        二抗连接的标记酶多为辣根过氧化物酶(HRP)或碱性磷酸酶(AP),标记酶通过生化反应与其底物产生有颜色的沉淀物,从而显示目的蛋白的位置和含量,一般常见各种底物信息如下:

辣根过氧化物酶     Horseradish peroxidase(HRP)

碱性磷酸酶                        Alkaline phosphatase(AP)

AEC (red)

Fast red(pink)

DAB (brown)

INT (yellow/ brown)

 

NBT (brown/ purple)

 

New Fuchsin (red)

 

TNBT (purple)

 

Vega red (pink)

 

        而荧光标记物用特殊波长的光激发时发射出可见光,CST采用的荧光标记物多为Alexa Fluor®系列染料,分别为Alexa Fluor®488、555,594和647。另外,CST还具有非可见光区的染料偶联抗体,主要使用的Dylight系列染料,分别为DyLight™680和DyLight™800 Conjugate。这些荧光染料的激发光和发射光波长信息如下。

 

最大激发波长

最大发射波长

Alexa Fluor® 488

490nm

525nm

Alexa Fluor® 555

555nm

580nm

Alexa Fluor® 594

590nm

617nm

Alexa Fluor® 647

650nm

665nm

DyLight™ 680

692nm

712nm

DyLight™ 800

777nm

794nm

        CST还有一些特殊的二抗用于特定的应用,如构象特异性或单链特异性二抗,是为了防止在免疫沉淀(IP)这一应用中二抗与微珠结合的抗体在后续的WB检测中发生交叉反应而特别设计的。

Mouse Anti-rabbit IgG (Light-Chain Specific) (L57A3) mAb #3677

Mouse Anti-rabbit IgG (Conformation Specific) (L27A9) mAb #3678

Mouse Anti-rabbit IgG (Conformation Specific) (L27A9) mAb (HRP Conjugate) #5127

 

如果您有任何抗体选择问题,请联系CST(China)技术支持:

CST(China)技术支持:

技术热线:4006-GREATQ or 4006-473287

电话:021-58356288

传真:021-58356116

E-mail: tech@cst-c.com.cn

 

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