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5876
PDGF Receptor α (D13C6) XP® Rabbit mAb (Alexa Fluor® 647 Conjugate)
抗体偶联物
单克隆抗体
R
Recombinant

PDGF Receptor α (D13C6) XP® Rabbit mAb (Alexa Fluor® 647 Conjugate) #5876

Citations (1)
Filter:
  1. F
Flow cytometric analysis of HCC827 (blue) or NCI-H1703 (green) cells using PDGF Receptor α (D13C6) XP® Rabbit mAb (Alexa Fluor® 647 Conjugate).
To Purchase # 5876S
Cat. # Size Price Inventory
5876S
100 µl  (50 tests)

Supporting Data

REACTIVITY H
SENSITIVITY Endogenous
MW (kDa)
Source/Isotype Rabbit IgG

Application Key:

  • WB-Western Blot
  • IP-Immunoprecipitation
  • IHC-Immunohistochemistry
  • ChIP-Chromatin Immunoprecipitation
  • C&R-CUT&RUN
  • C&T-CUT&Tag
  • DB-Dot Blot
  • eCLIP-eCLIP
  • IF-Immunofluorescence
  • F-Flow Cytometry

Species Cross-Reactivity Key:

  • H-Human
  • M-Mouse
  • R-Rat
  • Hm-Hamster
  • Mk-Monkey
  • Vir-Virus
  • Mi-Mink
  • C-Chicken
  • Dm-D. melanogaster
  • X-Xenopus
  • Z-Zebrafish
  • B-Bovine
  • Dg-Dog
  • Pg-Pig
  • Sc-S. cerevisiae
  • Ce-C. elegans
  • Hr-Horse
  • GP-Guinea Pig
  • Rab-Rabbit
  • All-All Species Expected

Product Description

This Cell Signaling Technology antibody is conjugated to Alexa Fluor® 647 fluorescent dye and tested in-house for direct flow cytometry analysis in human cells. The antibody is expected to exhibit the same species cross-reactivity as the unconjugated PDGF Receptor α (D13C6) XP® Rabbit mAb #5241.

Product Usage Information

Application Dilution
Flow Cytometry (Fixed/Permeabilized) 1:50
Flow Cytometry (Live) 1:50

Storage

Supplied in PBS (pH 7.2), less than 0.1% sodium azide and 2 mg/ml BSA. Store at 4°C. Do not aliquot the antibody. Protect from light. Do not freeze.

Protocol

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Flow Cytometry, Methanol Permeabilization Protocol for Directly Conjugated Antibodies

A. Solutions and Reagents

All reagents required for this protocol may be efficiently purchased together in our Intracellular Flow Cytometry Kit (Methanol) #13593, or individually using the catalog numbers listed below.

NOTE: Prepare solutions with reverse osmosis deionized (RODI) or equivalent grade water.

  1. 1X Phosphate Buffered Saline (PBS): To prepare 1 L 1X PBS: add 100 ml 10X PBS (#12528) to 900 ml water mix.
  2. 4% Formaldehyde, Methanol-Free (#47746)
  3. 100% Methanol (#13604): Chill before use
  4. Antibody Dilution Buffer: Purchase ready-to-use Flow Cytometry Antibody Dilution Buffer (#13616), or prepare a 0.5% BSA PBS buffer by dissolving 0.5 g Bovine Serum Albumin (BSA) (#9998) in 100 ml 1X PBS. Store at 4°C.

NOTE: When including fluorescent cellular dyes in your experiment (including viability dyes, DNA dyes, etc.), please refer to the dye product page for the recommended protocol. Visit www.cellsignal.com for a full listing of cellular dyes validated for use in flow cytometry.

B. Fixation

NOTE: Adherent cells or tissue should be dissociated and in single-cell suspension prior to fixation.

NOTE: Optimal centrifugation conditions will vary depending upon cell type and reagent volume. Generally, 150-300g for 1-5 minutes will be sufficient to pellet the cells.

NOTE: If using whole blood, lyse red blood cells and wash by centrifugation prior to fixation.

NOTE: Antibodies targeting CD markers or other extracellular proteins may be added prior to fixation if the epitope is disrupted by formaldehyde and/or methanol. The antibodies will remain bound to the target of interest during the fixation and permeabilization process. However, note that some fluorophores (including PE and APC) are damaged by methanol and thus should not be added prior to permeabilization. Conduct a small-scale experiment if you are unsure.

  1. Pellet cells by centrifugation and remove supernatant.
  2. Resuspend cells in approximately 100 µl 4% formaldehyde per 1 million cells. Mix well to dissociate pellet and prevent cross-linking of individual cells.
  3. Fix for 15 min at room temperature (20-25°C).
  4. Wash by centrifugation with excess 1X PBS. Discard supernatant in appropriate waste container. Resuspend cells in 0.5-1 ml 1X PBS. Proceed to Permeabilization step.
    1. Alternatively, cells may be stored overnight at 4°C in 1X PBS.

C. Permeabilization

  1. Permeabilize cells by adding ice-cold 100% methanol slowly to pre-chilled cells, while gently vortexing, to a final concentration of 90% methanol.
  2. Permeabilize for a minimum of 10 min on ice.
  3. Proceed with immunostaining (Section D) or store cells at -20°C in 90% methanol.

D. Immunostaining

NOTE: Count cells using a hemocytometer or alternative method.

  1. Aliquot desired number of cells into tubes or wells. (Generally, 5x105 to 1x106 cells per assay.)
  2. Wash cells by centrifugation in excess 1X PBS to remove methanol. Discard supernatant in appropriate waste container. Repeat if necessary.
  3. Resuspend cells in 100 µl of diluted primary antibody, prepared in Antibody Dilution Buffer at a recommended dilution or as determined via titration.
  4. Incubate for 1 hr at room temperature. Protect from light.
  5. Wash by centrifugation in Antibody Dilution Buffer or 1X PBS. Discard supernatant. Repeat.
  6. Resuspend cells in 200-500 µl of 1X PBS and analyze on flow cytometer.

posted July 2009

revised June 2020

实验步骤编号:407

流式细胞术,针对直接结合抗体的活细胞实验步骤

A. 溶液与试剂

:使用反渗透去离子水 (RODI) 或同等级别的水配制溶液。

  1. 1 X 磷酸盐缓冲生理盐水 (PBS):要配制 1 L 1X PBS:将 100 ml 10X PBS (#12528) 添加到 900 ml 水,混合。
  2. 抗体稀释缓冲液:购买即用型流式细胞术抗体稀释缓冲液 (#13616),或在 100 ml 1x PBS 中溶解 0.5 g 牛血清白蛋白 (BSA) (#9998) 来配制 0.5 % BSA PBS 缓冲液。4°C 保存。

:在您的实验中加入荧光细胞染料(包括活力指示染料、DNA 染料等)时,请参考染料产品网页,了解建议的实验步骤。访问 www.cellsignal.com,了解经验证用于流式细胞术的细胞染料完整列表。

B. 免疫染色

:使用血细胞计数器或备选方法计数细胞。

:如果使用全血,则需裂解红血细胞,并在免疫染色之前通过离心分离洗涤。

:人 Fc 受体与兔 IgG 发生交叉反应。当感兴趣的细胞表达高水平的 Fc 受体蛋白(例如,巨噬细胞/单核细胞谱系)时,在用兔抗体进行免疫染色之前,用人 Fc 块预孵育活细胞。

:最佳离心条件会根据细胞类型和试剂容量变动。一般,1-5 分钟 150-300g 将足以使细胞沉淀下来。

  1. 将所需数目的细胞分装入试管或小孔中。(通常,每次测定 5 x 105 至 1 x 106 个细胞。)
  2. 通过离心使细胞沉淀下来,移除上清液。
  3. 在 100 µl 稀释的一抗中重悬细胞,这种一抗按建议的稀释度或如通过滴定所确定那样以抗体稀释缓冲液配制。
  4. 在冰上孵育 30 分钟至 1 小时。避光。
  5. 用抗体稀释缓冲液进行离心洗涤。弃去上清液。重复。
  6. 在 200-500 μl 抗体稀释缓冲液中重悬细胞后用流式细胞分析仪进行分析。

发布​时间 2017 年 6 月

修订时间 2022 年 1 月

实验步骤编号:1504

特异性/灵敏度

PDGF Receptor α (D13C6) XP® Rabbit mAb (Alexa Fluor® 647 Conjugate) 可识别内源水平的 PDGF 受体 α 蛋白。

物种反应性:

来源/纯化

使用与 PDGF 受体 α 胞外域相对应的重组蛋白,对动物进行免疫接种来产生单克隆抗体。

背景

血小板源性生长因子 (PDGF) 家族蛋白具有许多二硫键连接的二聚同工型(PDGF AA、PDGF AB、PDGF BB、PDGF CC 和 PDGF DD),这些同工型可以特定方式结合两种紧密相关的受体酪氨酸激酶:PDGF 受体 α (PDGFRα) 和 PDGF 受体 β (PDGFRβ)。PDGFRα 和 PDGFRβ 在其两个胞内激酶结构域之间有75%-85% 的序列同源性,而在激酶插入和羧基末端尾区之间的同源性水平较低 (27%-28%) (1)。PDGFRα 同型二聚体可结合所有 PDGF 同工型(包含 PDGF D 的同工型除外)。PDGFRβ 同型二聚体可结合 PDGF BB 和 DD 同工型以及 PDGF AB 异二聚体。异聚体 PDGF 受体 α/β 可结合 PDGF B、C 和 D 同型二聚体以及 PDGF AB 异二聚体 (2)。PDGFRα 和 PDGFRβ 可各自与 EGFR 形成异二聚体,EGFR 也被 PDGF 激活 (3)。不同细胞的受体总数和受体亚基组成有所不同,这可能是因为不同细胞类型对 PDGF 结合的反应有差异 (4)。结合配体会诱导受体二聚化和自磷酸化,随后结合和激活包含细胞浆 SH2 结构域的信号转导分子,如 GRB2、Src、GAP、PI3 激酶、PLCγ 和 NCK。激活的 PDGF 受体会启动许多不同的信号转导通路,从而调控细胞生长、肌动蛋白重组、迁移和分化 (5)。PDGFRβ 激酶插入区域中的 Tyr751 是 PI3 激酶的锚定位点 (6)。PDGFRβ (pTyr751-Val-Pro-Met-Leu) Tyr751 产生的磷酸化五肽可抑制 PI3 激酶 p85 亚基的羧基末端 SH2 结构域与 PDGFRβ 的结合 (7)。PDGFRβ 介导的 PI3 激酶激活也需要 Tyr740 (8)。

通路

探索与本品相关的通路。

有限使用

除非如以 CST 合法授权代表签署的书面形式另行明确同意,否则以下条款适用于 CST、其附属公司或其分销商提供的产品。除非 CST 合法授权代表以书面形式单独接受,否则任何附加于或异于此处所载条款和条件的客户条款和条件均被拒绝且无效。

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仅供研究使用。不得用于诊断流程。
Cell Signaling Technology 是 Cell Signaling Technology, Inc. 的商标。
XP 是 Cell Signaling Technology, Inc. 的注册商标。
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