Cell Signaling Technology

常见问题与帮助

常见问题

问题回复

我该如何储存我的抗体?多高的温度会影响抗体的稳定性?

请将抗体的原始管储存到-20°C,不要分装,否则有可能引起抗体的改变和浪费。提供的抗体贮存在包含50%甘油缓冲液中,在推荐的储存温度下不会冷冻。这避免了由于反复冻融导致的抗体降解。偶联抗体可能储存在4°C,请参照产品说明书上的建议储存。

如何储存SDS 裂解的磷酸化蛋白样本?

如果短期内使用( 少于3 个月)SDS 样本细胞裂解液可以储存在-20℃,如果长期储存,应保存于-80℃。活化的蛋白样本的降解变化很大,其降解率取决于每种蛋白的性质和样本里究竟含有多少活化的蛋白。

能用室温孵育抗体1 小时代替4℃过夜吗?

不建议。CST 公司活化特异的抗体用于区分一或两个翻译后修饰的氨基酸残基。这些修饰包括磷酸化,乙酰化和酶切割。与识别总蛋白的抗体相比,大多数针对这些修饰位点的抗体具有较低的亲和性。因此,通过4℃孵育过夜延长抗原和抗体的反应时间以获得最好的信噪比是非常关键的。

当我准备细胞裂解液样品时,需使用什么缓冲液?

请检查每个产品说明书中包含的Western blot 操作步骤中推荐的缓冲液。CST 提供以下缓冲液( 见下表),或者,如果你想自己配制,CST 网站上列出了特别的缓冲液组分。CHAPS 缓冲液专为获得细胞质的提取物而设计,适应Caspase 的检测,但并非关键。

样本处理

推荐使用缓冲液

全细胞裂解物,使用标准

SDS-PAGE 上样缓冲液

#7722 #7723

蓝色的上样缓冲液包装

#7722 或红色的上样缓冲液

包装#7723

免疫沉淀和/ 或激酶分析,

使用#9803

细胞裂解缓冲液(10X)

#9803

切割的半胱天冬酶和其底

物的免疫印迹,使用#9852

CHAPS 缓冲液(10X) #9852

CST 的抗体是否适用于全组织样本裂解物?

CST 并未测试所有抗体是否适用于全组织样本裂解物,但是CST 的很多抗体已经被其他客户用于整个组织而且取得巨大成功。

如何为磷酸化目标蛋白准备阳性细胞裂解液对照?

请参考CST 网站上该产品的Western blot 图,使用图述的细胞系和药物处理,能够得到阳性对照蛋白。也可参见:www.cellsignal.com/support/controls.html 查阅。

假如说明书上某个种属未被列出与CST抗体有交叉反应,是否意味着这个种属未被检测过呢?

可能未被检测过。CST科学家检测所有CST抗体在多个物种的交叉反应性,如果可能的话(这个依赖于目标蛋白和实验系统的可行性)。假如我们没有获得某个种属的交叉反应的阳性结果,我们就不会列出这个种属。然而,有可能我们检测的这个细胞系包含一个低水平的特定蛋白,或者,我们使用的诱导条件对那个特定的细胞系不起作用。如果您需要针对某个种属交叉反应的更多信息,请随时联系我们的技术支持团队tech@cst-c.com.cn来获取帮助。

使用CST抗体时,为什么我不能使用我们自己实验室的免疫印迹操作流程?

CST™抗体经过优化以提供最强的信号,最少的背景,使用CST推荐的免疫印迹操作流程,对于终端客户的优点是节约时间和材料。

 

如何确保Western blot 结果的可重复性?

至于为什么看起来较难重复Western blot 结果,这里有几种可能性。要发现这种情况的原因,可考虑以下:

• 你是如何储存抗体的?请参考问题1,2。

• 抗体稀释后不能重复使用。许多抗体有一个非常低的工作浓度,很可能这个浓度随着连续的Western blot 会减少。

• 你确定你的样本中包含活化的蛋白?细胞裂解液样品制备活化蛋白会由于细胞数量,药物诱导时间,细胞传代数量和储存条件不同而改变。

• CST 产品在其保质期内都有最佳表现。请邮件tech@cst-c.com.cn咨询产品保质期页面获得列表。请注意:不能分装抗体。

如何使用固相抗体来做免疫沉淀?

要得到最佳的结果,获得均匀的微珠悬浮液是重要的。以下步骤可确保同质:

• 将包含微珠悬浮液的管子放入冰桶10 分钟。

• 倒置管子几次以获得50% 微珠- 缓冲液悬浮液。

• 假如可能,温和漩涡管子。

• 为了迅速吸出产品,切掉吸管端头,将吸管端头插入

微珠悬浮液使靠近固相抗体微珠混合物。孵育抗体和200μg的细胞裂解物( 1mg/ml)4℃过夜,用推荐的抗体稀释浓度。

当有多种抗体可以选择时,哪一种在我的实验中表现最优?

通常,CST会针对一个目标蛋白提供多个抗体。选择在您接下来的实验中表现最优的抗体,可以访问抗体对照表格或者联系CST技术支持tech@cst-c.com.cn来获取帮助,进而选择最适合您实验的最优抗体。

CST如何确保抗体的质量?

CST科学家努力检测所有产品的主要应用,例如免疫印迹,免疫沉淀,免疫荧光,免疫组织化学,流式细胞术,和染色质免疫沉淀。当一个抗体被推荐用来某个特定的应用,说明这个抗体已经通过了严格的特异性实验测试的标准。此外,我们的科学家针对每个产品创建了专门的(优化的)免疫染色的方法,为您节约时间和试剂。我们也常规检测我们的抗体在不同物种的应用,包括人类,猴子,小鼠和大鼠。产品的高质量是CST最关心的。如果您对某个没有在产品页面列出的某个特定的应用感兴趣,请联系CST技术支持tech@cst-c.com.cn,来获取更多的信息。

对于不同的批次,CST如何对质量进行控制?

CST 科学家努力达到每批产品的一致性。作为标准,我们在新的批次中检测以往批次的所有应用。每个批次每个应用推荐的浓度都经过优化,所以请遵循我们的操作步骤。您可以浏览我们的免疫印迹验证页面获取更多知识。

我能够订购一个定制配方的抗体吗?

针对客户(不含载体)的订单,许多制备在不含BSA或甘油的PBS中的抗体都有库存。这个配方可以为了偶联而更改,能够连接到荧光素,微珠,或者染料。为了满足您分析的需要或者您实验室的需要,我们也很高兴向您整批出售。关于价格和可用性的问题,您可以联系我们info@cst-c.com.cn

CST能够定制我的抗体吗?

CST不会开发定制抗体,但是我们很高兴接受您的目标蛋白抗体建议。请发送您的建议到info@cst-c.com.cn,CST科学家将在短期之内联系您。

需要更进一步的帮助吗?

对于一般的产品问题,请联系info@cst-c.com.cn

为什么我们的抗体能够在常温下运输?

与CST在环境方面的巨大努力一致,我们从2003年开始,在常温下运输抗体,尽可能的减少包装材料的浪费。每个CST™抗体都需经过稳定性检测,先在常温和37°C下放置一周,然后进行免疫印迹测试以确保抗体的性能没有改变。如果你收到的抗体保存在常温中,请放心它已经通过稳定性测试,抗体的性能仍然是最优的。抗体接收后,请按照产品说明书中的推荐温度储存。

这个抗体是否做够做这些实验(免疫印迹,免疫沉淀,免疫荧光,免疫组织化学,流式细胞术,染色体免疫沉淀)?

CST会例行在相关的实验中测试抗体。这些被推荐的应用,都通过了严格的应用特定的验证标准。我们仅会推荐通过严格验证标准的应用,如果这个实验数据是模棱两可的,我们是不会推荐这个应用的。关于某个特定的抗体的更多信息或者咨询哪种抗体将在您的实验中表现最佳,可以联系CST的技术支持团队 tech@cst-c.com.cn

这个抗体能否用来做荧光免疫印迹?

CST并没有对抗体是否能够做荧光免疫印迹进行常规测试,尽管在这个实验中许多抗体是发挥作用的。使用CST的抗体做荧光免疫印迹时,需要使用经修改过的免疫印迹的操作流程。我们发现去除封闭步骤中的Tween® 20去污剂(在TBS中只使用5%的脱脂奶粉)和在显影前干燥膜是针对标准流程做出的仅有的必要改变。详细信息能够在荧光Western免疫印迹操作步骤(一抗用BSA孵育)和荧光Western免疫印迹操作步骤(一抗用牛奶孵育)中找到。另外,Prestained Protein Marker, Broad Range (Premixed Format) #7720在近红外波段中具有自发荧光。

我的抗体的浓度是多少?

在CST,我们依据抗体活性来制备抗体,会为您做出调整。为了达到最优的效果,不同批次抗体的浓度有时会做出调整。咨询特定批次抗体的浓度,请联系CST中国技术支持:tech@cst-c.com.cn或 电话 4006-473287。

为什么我的 WB 实验中没有得到目标蛋白条带?该如何应对?

经过长期处理客户技术问题,我们发现,很多问题竟都是出在样本制备这一步,抗体出现问题的比例极小。做 WB 和 IP 的时候,一些抗体对实验条件尤其敏感。我们建议客户首先要确定以下几个基本问题:

   a)  目的细胞是否表达这种蛋白,丰度如何?

   b)  提取蛋白的细胞裂解液中是否加入蛋白酶抑制剂,防止降解。

   c)  是否按照 CST 建议的操作方法进行改善实验?

   d)  刺激处理是否恰当?

   e)  抗体是否有问题,我们提供专门的细胞裂解物来用于检测您的抗体是否存在问题,这是最好和最快捷的方法。

湿转,半干转适用于 CST 抗体吗?

美国科研团队已尝试用不同的方法去转膜,但并非每一种方法都尝试过。曾测试过的转膜系统有 Life Technology’s iBind , Life Technology’s iBlot , Millipore’s SNAPi.d. , BioRad’s TransBlot Turbo 。当用不同的转膜系统时,建议优化 SDS-PAGE 凝胶电泳、转膜以及各种条件。通常,推荐用湿转法。

做磷酸化抗体的时候一定要用脱脂奶粉稀释吗?

一些客户认为在做磷酸化抗体的时候,用脱脂奶粉来封闭会引起比较高的背景,并且喜欢用 PBS 来作为稀释液,但是这些说法是没有科学依据的。CST 的技术专家团队推荐用 5% 脱脂奶粉,TBS ,0.1% Tween®20 ,室温下 1 小时来封闭一抗。

制备样品为什么要超声?如果没有超声仪,有什么替代方法?

每个超声仪的最佳设置需单独确定,我们推荐在 35%-40% 功率下处理10-15秒,重复3次(处理期间样品置于冰上),以期完全裂解细胞并打碎核染色质,减少样品的粘稠度,对检测膜结合蛋白和核蛋白非常重要。如果没有超声波破碎仪,也可用细的 21G 针头抽吸样品来破碎。 若样本太黏稠,可先用 16 或 18G ,然后再用 21G 。

不同的细胞组分有相应的 loading control 吗?

可以在 http://www.cellsignal.com/catalog/loading-controls.html 网页上找到答案。比如 VDAC (D73D12) Rabbit mAb #4661 可以作为线粒体内参。Cell Fractionation Antibody Sampler Kit #11843 就包含几种不同的内参: Histone H3 (D1H2) XP® Rabbit mAb #4499 可以作为核内参;AIF (D39D2) XP® Rabbit mAb #5318 可以作为线粒体内参;Vimentin (D21H3) XP® Rabbit mAb #5741 是细胞骨架的标志物;MEK1/2 (D1A5) Rabbit mAb #8727 可以作为细胞质内参。

转膜时,该如何选择膜孔径?对大分子量和小分子量蛋白有哪些需要特别注意的地方?

对所有的蛋白,我们推荐用 Nitrocellulose Sandwiches #12369 (0.2um) 的杂交膜去转膜,尤其是分子量低于 30 KD 的蛋白,建议使用较高浓度 (12-15%) 的蛋白分离胶并缩短转膜的时间,建议在 1 小时以内。

大分子量蛋白(>150 kDa)推荐使用 tris-acetate SDS-PAGE 凝胶系统,而不是传统的(tris-glycine),以及 5% 的甲醇。因为 tris-acetate 凝胶是在一个中性 pH 的条件下,所以分辨率比较高而且迁移的也更加精准。低浓度的甲醇可以使转膜的效率更高 (25 mM Tris base, 0.2 M glycine, 5% methanol)。长时间的转膜(3小时,70 伏)也是很有帮助的。对 mTOR 来说长时间的转膜可能不一定有效,因为 mTOR 是一个高表达的蛋白,一般来说用常规的 protocol 也可以得到比较好的实验结果,但对于 BRCA1 , ATM ,ATR 等这些大分子量蛋白却十分有帮助。

WB 时,如何选择阳性对照?

CST 的科学家制定了一个一些抗体的对照表格,可在网页 http://www.cellsignal.com/support/controls.html 找到答案,但是有些蛋白可能只是在特定模型中或者特定的刺激中表达,所以这些蛋白并没有合适的对照,您可参考说明书中提供的图片上的细胞系来做对照。

荧光 WB 和 CST 推荐的常规 WB 有什么区别?

区别主要有 2 点:

(1) 在封闭液中不要加入 Tween-20 ;

(2) 在曝光之前要保持膜的干燥。

一般在 LI-COR Odyssey® 和其他的荧光体系下,CST 的抗体都会有不错的表现。当用荧光 WB 出现问题的时候,我们建议客户在最亮的通道(通常是DyLight® 680 Conjugate)下检测并且避免多通道检测。也可参考网页上我们推荐的荧光 WB 步骤: http://www.cellsignal.com/support/tech_fluorescent_western.html.

为什么有些抗体的实际分子量和说明书中的分子量会有所偏差?

原因很多,要根据实际情况加以判断。a) 如果是 1~5kD 的偏差,都是正常的,因为很多蛋白在不断研究中发现,存在多种蛋白翻译后修饰,如磷酸化、泛素化、糖基化等等,会造成蛋白电泳行为的偏移,从而影响蛋白实际条带的位置;b)如果蛋白被体外的蛋白酶降解,也会造成分子量变小的情况,这时偏移较大,需要考虑样品制备和保存的问题,防止降解;c)如果出现条带比预期分子量成倍增加,考虑是不是存在多聚体的情况;d)一些蛋白复合体在裂解时没有充分分离,个别情况下会存在条带偏差,如 ATG5-ATG12 复合体,当使用 ATG5 的抗体去杂交,就有可能出现 ATG5-ATG12 复合体的条带;e)所使用的细胞系是否多次传代,因为多次传代的肿瘤细胞,有可能出现蛋白分子量偏移的问题,主要是转录本发生了变化;f)个别情况下,蛋白对应基因发生异位,造成重组蛋白,影响分子量;g)抗体质量问题,特异性受到影响,建议使用我们提供的阳性对照裂解物去查找抗体是否有问题。h)SDS-PAGE 凝胶的成分和跑胶的条件以及 marker 也都是一些重要的影响因子。

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